Оценка оксидативного стресса и морфофункционального статуса ооцитов Sus scrofa domesticus, витрифицированных в присутствии TTP_EG*10PEG

Витрификация незрелых ооцитов является одним из ключевых способов сохранения репродуктивных клеток Sus scrofa domesticus для экспериментальной работы и интенсификации внедрения вспомогательных репродуктивных технологий в ветеринарию, инновационных исследований в биомедицине и фармацевтике. В связи с этим, возникает необходимость совершенствования уже имеющихся и формирования новых протоколов витрификации женских гамет свиней. Сегодня ведутся активные исследования, направленные на применение различных гидрогелей для витрификации в области вспомогательных репродуктивных технологий людей, экспериментальных и сельскохозяйственных животных. Появление новых синтезированных прекурсоров для формирования гидрогелей расширяет возможности криоконсервации, однако, требует предварительного анализа на их цитотоксичность. Данное исследование направлено на оценку цитотоксичности прекурсора гидрогеля тетраполиэтиленгликолята титана в 10 мольном избытке полиэтиленгликоля (TTP_EG*10PEG), использованного в качестве добавки в криопротекторы в протоколе криоконсервации ооцитов свиней на стадии зародышевого пузырька. Ооциткумулюсные комплексы (ОКК) получали из фолликулов (диаметр 3-5 мм) постмортальных яичников свиней, ранжировали на 4 группы. Экспериментальные группы обрабатывали растворами криопротекторов (КПА), приготовленными на основе среды ТС-199 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки: КПА-1 – 0,7 M диметилсульфоксида (ДМСО)+0,9 M этиленгликоля (ЭГ) (экспонирование 30 с); КПА2 – 1,4 M ДМСО+1,8 M ЭГ (экспонирование 30с); КПА-3 – 2,8 M ДМСО+3,6 M ЭГ+0,65 M трегалозы (экспонирование 20с). Для создания условий опыта в КПА-3 трех экспериментальных групп добавляли TTPEG*10PEG в концентрациях 0,1, 0,01 и 0,001%. После обработки криопротекторами клетки загружали в соломины и помещали в сосуды Дьюара с LN2 (−196 °С) не менее чем на 1 ч. После девитрификации на водяной бане (120 сек. при 38 °С), проводили оценку статуса хроматина денудированных ооцитов (1,9 μM Hoechst33342), уровня активных форм кислорода (АФК) с помощью флуорохрома DCFH-DA (раб. концентрация 5 мкМ/мл) и митохондриальной активности (500 нМ MitoTracker Orange CMTMRos). Выявлено, что добавление в КПА 0,1, 0,01 и 0,001% TTP_EG*10PEG не вызывало достоверного снижения доли клеток с признаками дегенерации после витрификации, отмечено повышение генерации АФК (на 29,5 усл. ед., 34,1 усл. ед. и 15,8 усл. ед. ИФ DCFH-DA) и уровня митохондриальной активности (на 49,21 усл. ед., 31,89 усл. ед., 37,22 усл. ед. ИФ Mito Orange CMTMRos), что не позволяет рекомендовать применение TTP_EG*10PEG в концентрациях 0,1, 0,01, 0,001% при моделировании состава криопротекторных сред для витрификации ооцитов ввиду отсутствия положительного эффекта на показатели жизнеспособности и морфофункциональной активности девитрифицированных клеток. Мониторинг всех вышеуказанных контролируемых показателей в исследованных концентрациях (0,1, 0,01 и 0,001%) выявил цитотоксичные эффекты на криосохранность женских гамет, что указывает на нецелесообразность использования прекурсора TTP_EG*10PEG в технологии витрификации донорских ооцитов свиней.

1. Deręgowska A., Solarska-Ściuk K., Wnuk M., Schwarzbacherová V. Pig as an interorgan communication model and its applications in biomaterials, drug delivery, and bioengineering research. Comprehensive Physiology. 2025; 15(5):70043. doi: 10.1002/cph4.70043

2. Wei J., Zhang W., Li J., Jin Y., Qiu Z. Application of the transgenic pig model in biomedical research: A review. Frontiers in cell and developmental biology. 2022;10:1031812. doi: 10.3389/fcell.2022.1031812

3. Кузьмина Т. И. Влияние витрификации на функционирование актинового цитоскелета в ооцитах свиней. Ветеринария. 2025;12:44-49. DOI:10.30896/0042-4846.2025.28.12.44-49

4. Кузьмина Т. И., Станиславович Т. И. Влияние витрификации на статус хроматина ооцит-кумулюсных комплексов Sus Scrofa Domesticus. Генетика и разведение животных. 2019;1; 27-33.

5. López A., Ducolomb Y., Casas E., Retana-Márquez S., Betancourt M., F. Casillas. Effects of porcine immature oocyte vitrification on actin microfilament distribution and chromatin integrity during early embryo development in vitro. Frontiers in cell and developmental biology. 2021; 9:636765. doi: 10.3389/fcell.2021.636765

6. Nohalez A., Martinez C. A., Gil M. A., Almiñana C., Roca J., Martinez E. A., Cuello C. Effects of two combinations of cryoprotectants on the in vitro developmental capacity of vitrified immature porcine oocytes. Theriogenology. 2015;84 (4):545-52. doi: 10.1016/j.theriogenology.2015.04.004

7. Wiltshire A., Schaal R., Wang F., Tsou T., McKerrow W., Keefe D. Vitrification with dimethyl sulfoxide induces transcriptomic alteration of gene and transposable element expression in immature human oocytes. Genes. 2023;14:1232. https://doi.org/10.3390/genes14061232

8. Zhu Y., Liu H., Zheng L., Luo Y., Zhou G., Li J., Hou Y., Fu X. Vitrification of mammalian oocytes: recent studies on mitochondrial dysfunction. bioreserve biobank. 2024;22(5):428-440. doi: 10.1089/bio.2023.0062

9. Tian C., Shen L., Gong C., Cao Y., Shi Q., Zhao G. Microencapsulation and nanowarming enables vitrification cryopreservation of mouse preantral follicles. Nature communications. 2022. 15;13(1):7515. https://doi.org/10.1038/s41467-022-34549-2

10. Desai N., Attard M., Spangler M., Gishto A., Brown A., Wirtjes M. Application of a novel hyaluronan hydrogel for three-dimensional follicle culture and methodology for mouse ovarian follicle cryopreservation. Journal of visualized experiments : JoVE. 2025;(219):10.3791/67786. doi:10.3791/67786

11. Francés-Herrero E., Lopez R., Campo H., de Miguel-Gómez L., Rodríguez-Eguren A., Faus A., Pellicer A., Cervelló I. Advances of xenogeneic ovarian extracellular matrix hydrogels for in vitro follicle development and oocyte maturation. Biomaterials advances. 2023;151:213480. doi: 10.1016/j.bioadv.2023.213480

12. Chang T., Zhao G. Ice inhibition for cryopreservation: materials, strategies, and challenges. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2021;8(6):2002425. doi:10.1002/advs.202002425

13. Huang M., Hu M., Cai G., Wei H., Huang S., Zheng E., Wu Z. Overcoming ice: cutting-edge materials and advanced strategies for effective cryopreservation of biosample. Journal of nanobiotechnology. 2025;23(1):187. https://doi.org/10.1186/s12951-025-03265-6

14. Khonina T. G., Safronov A. P., Ivanenko M. V., Chupakhin O. N., Pushin V. G. Titanium polyethylene glycolates and hydrogels on the basis of the glycolates. Russian Chemical Bulletin. 2014;63(7):1639-1642. doi:10.1007/s11172-014-0647-y

15. Dikalov S. I., Harrison D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 2014;20(2):372-382. DOI:10.1089/ars.2012.4886

16. Sato A., Sarentonglaga B., Ogata K., Yamaguchi M., Hara A., Atchalalt K., Sugane N., Fukumori R., Nagao Y. Effects of insulin-like growth factor-1 on the in vitro maturation of canine oocytes. The Journal of reproduction and development. 2018;64(1):83-88. doi:10.1262/jrd.2017-145

17. Momeni A., Haghpanah T., Nematollahi-Mahani S. N., Ashourzadeh S., Eftekhar-Vaghefi S. H. Comparing the effects of vitrification, before and after mouse oocyte in vitro maturation on developmental competence, changes in epigenetic regulators and stress oxidative response. Biochemical and biophysical research communications. 2023;679:179-190. doi: 10.1016/j.bbrc.2023.09.005

18. Ren J., Liu G., Cui H., Dong X., Mao S., Liu Y., Dai Y. Effect of glutathione addition on vitrification of ovine oocytes. Theriogenology. 2025;240:117412. doi: 10.1016/j.theriogenology.2025.117412

19. López A., Ducolomb Y., Casas E., Retana-Márquez S., Betancourt M., Casillas F. Effects of Porcine Immature Oocyte Vitrification on Actin Microfilament Distribution and Chromatin Integrity During Early Embryo Development in vitro. Frontiers in cell and developmental biology. 2021;9:636765. doi: 10.3389/fcell.2021.636765

20. Santacruz-Márquez R., Solorio-Rodríguez A., González-Posos S., García-Zepeda S. P., Santoyo-Salazar J., De Vizcaya-Ruiz A., Hernández-Ochoa I. Comparative effects of TiO2 and ZnO nanoparticles on growth and ultrastructure of ovarian antral follicles. Reproductive toxicology (Elmsford, N.Y.). 2020;96:399-412. doi: 10.1016/j.reprotox.2020.08.003

21. Cao B., Qin J., Pan B, et al. Oxidative Stress and Oocyte Cryopreservation: Recent Advances in Mitigation Strategies Involving Antioxidants. Cells. 2022;11(22):3573. Published 2022 Nov 11. doi:10.3390/cells11223573

22. Xu X., Cowley S., Flaim C. J., James W., Seymour L., Cui Z. The roles of apoptotic pathways in the low recovery rate after cryopreservation of dissociated human embryonic stem cells. Biotechnology progress. 2010;26:827–837. doi: 10.1002/btpr.368