Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц с применением мультиплексной ПЦР

Метапневмовирусная инфекция птиц причиняет значительный экономический ущерб птицеводству, который складывается из потерь от снижения сохранности и продуктивности, а также затрат на проведение оздоровительных и профилактических мероприятий.

Возбудителем заболевания является метапневмовирус птиц семейство Paramyxoviridae подсемейство Pneumovirinae род Metapneumovirus.

Вирусный геном состоит из 8 генов кодирующих 9 белков: N-нуклеопротеин, P-фосфопротеин, Mматричный белок, F-белок слияния, M2 (М2-1,М2-2) - фактор элонгации/транскриптации, SH-(малый) гидрофобный белок, G-гликопротеин, L-(большой) полимеразный. У вируса отсутствуют неструктурные белки NS1 и NS2, оказывающие противодействие интерферону.

Основываясь на нуклеотидной последовательности вариабельного гена гликопротеина G, метапневмовирус птиц был классифицирован на четыре подтипа A, B, C и D. Два недавно обнаруженных вируса GuMPV и AMPV PAR-05 у попугая и чайки в Северной Америке являются предполагаемыми новыми подтипами метапневмовируса птиц.

Многообразие подтипов возбудителя и различия вирулентных свойств метапневмовируса создают сложности как при профилактике данного заболевания, так и при его диагностике.

Сложность выделения метапневмовируса из исследуемого материала обусловлена коротким периодом персистенции вируса в органах птиц. Молекулярно-биологическим методом выделить РНК возбудителя МПВИ можно в течение 17-19 дней после заражения. Целью нашей работы было разработка и апробация праймеров и зондов для одновременного выявления и дифференциации метапневмовируса птиц подтипов А и В методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, обладающими высокой специфичностью.

С использованием вакцинных штаммов 8544 и VC-03 были подобраны условия для проведения ПЦР по составу ПЦР-смеси и по температуре отжига праймеров и зондов.

При проведении ПЦР мы регистрировали сигнал флуоресценции по каналу FAM для кДНК полученной из вакцинного штамма 8544, и по каналу НЕХ для вакцинного штамма VC-03.

Специфичность разработанных праймеров и зондов была проверена также в исследованиях с геторогенными вирусами, такими как ньюкаслская болезнь, классическим и вариантным штаммми вируса инфекционного бронхита кур и с ДНК птицы.

Проведенные исследования по определению специфичности подобранных нами праймеров для мультиплексной ПЦР диагностики позволяют одновременно и обнаружить подтипы А и В возбудителя МПВИ птиц в режиме реального времени по разным каналам флуоресценции, в то время как другие нецелевые респираторные патогены не наблюдались.

1. Абгарян, С.Р. Молекулярно-биологическая диагностика респираторных болезней птиц / С. Р. Абгарян, Н. В. Никитина, А. Н. Семина // Международный вестник ветеринарии. – 2019. – № 3. – С. 11-15.

2. Никитина, Н. В. Выделение метапневмовируса птиц на различных биологических системах / Н. В. Никитина, С. Р. Абгарян // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2019. – № 2. – С. 34-36.

3. Панкратов, С. В. Метапневмовирусная инфекция птиц / С. В. Панкратов, С. Р. Абгарян // Нормативно-правовое регулирование в ветеринарии. – 2022. – № 3. – С. 36-39.

4. Панкратов, С. В. Метапневмовирусная инфекция птиц / С. В. Панкратов, С. Р. Абгарян // Нормативно-правовое регулирование в ветеринарии. – 2022. – № 3. – С. 36-39.

5. Панкратов С.В. Респираторный синдром птиц. Этиология, диагностика, меры борьбы и профилактики / Панкратов С.В., Рождественская Т.Н., Сухинин А.А., Рузина А.В. // Птица и птицепродукты. – 2021. – № 4. – С. 34-36.

6. Панкратов С.В. Ассоциированная иммунизация и усовершенствование технологии производства вакцин против респираторного микоплазмоза и вирусных болезней птиц: дис. ... канд. вет. наук: 06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология / С.-Петерб. гос. Академия ветеринарной медицины. СПб., 2013. 130 с.

7. Рождественская Т.Н. Профилактика метапневмовирусной инфекции птиц / Рождественская Т.Н., Норкина С.Н., Николаева И.П., Крон Н.В., Авситидийский Е.А., Панкратов С.В. // Птица и птицепродукты. – 2022. – № 4. – С. 52-55.

8. Семина, А. Н. Идентификации salmonella enteritidis и salmonella typhimurium методом полимеразно цепной реакции / А. Н. Семина, С. Р. Абгарян // Международный вестник ветеринарии. – 2018. – № 4. – С. 39-43.

9. Сулян О.С. Ассоциированная устойчивость к полимиксину и бета-лактамам Echerichia coli, выделенных от людей и животных / О.С. Сулян, В.А. Агеевец, А.А. Сухинин, И.В. Агеевец, С.Р. Абгарян, С.А. Макавчик, О.А. Каменева, К.Г. Косякова, Т.М. Мругова, Д.А. Попов, О.Е. Пунченко, С.В. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. – 2021 – Т.66. – №11-12. – С.9-17.

10. Jesse ST, Ludlow M, Osterhaus ADME. Zoonotic Origins of Human Metapneumovirus: A Journey from Birds to Humans. Viruses. 2022 Mar 25;14 (4):677. doi: 10.3390/v14040677. PMID: 35458407; PMCID: PMC9028271. Zoonotic Origins of Human Metapneumovirus: A Journey from Birds to Humans - PMC (nih.gov)

11. Randhawa JS, Marriott AC, Pringle CR, Easton AJ. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. J Virol. 1997 Dec;71(12):9849-54. doi: 10.1128/JVI.71.12.9849-9854.1997. PMID: 9371659; PMCID: PMC230303. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. - PMC (nih.gov)