Методологические аспекты контроля качества рекомбинантных субстанций в производстве ветеринарных препаратов

Активное внедрение генно-инженерных технологий в производство ветеринарных препаратов требует пересмотра и адаптации существующих стратегий обеспечения качества. Целью работы является систематизация методологических подходов к оценке качества субстанций, получаемых с использованием технологий рекомбинантных ДНК, с учетом современных регуляторных требований. В исследовании проведен анализ нормативно-правовой базы РФ и ЕЭАС (Государственная фармакопея РФ, решения ЕЭК), а также международных руководств VICH и WOAH. Рассмотрены современные аналитические и молекулярно-биологические методы, применяемые в биофармацевтике. В работе описан алгоритм контроля качества на всех этапах производственного цикла: от характеристики банков клеток до выпуска очищенной субстанции. Особое внимание уделено специфическим аспектам контроля рекомбинантных продуктов: подтверждению генетической стабильности организмов-продуцентов, мониторингу копийности плазмид и уровня экспрессии белка. Систематизированы требования к чистоте субстанций, включая контроль профиля родственных примесей и контаминантов процесса (остаточная ДНК, белки клетки-хозяина. Проведен сравнительный анализ методов оценки подлинности субстанций. В заключение показано, что современная стратегия контроля качества в ветеринарии смещается от использования вариабельных (in vivo) методов на лабораторных животных к высокоточным инструментальным методам анализа. Обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации методов контроля для обеспечения безопасности и эффективности рекомбинантных вакцин.

1. Мыца Е.Д., Чертова Н.В., Эльберт Е.В., Сухно А.С., Волкова Р.А., Меркулов В.А. Молекулярно-биологические методы контроля качества субстанций биологических лекарственных препаратов, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018; 18(2):75–80. DOI: 10.30895/2221-996X-2018-18-2-75-80.

2. Chambers M.A., Graham S.P., La Ragione R.M. Challenges in Veterinary Vaccine Development and Immunization. Methods Mol Biol. 2016; 1404:3-35. DOI: 10.1007/978-1-4939-3389-1_1.

3. Mossie T. Review on Recent Advance in Veterinary Vaccine. Animal and Veterinary Sciences. 2022; 10(5): 148-154. DOI: 10.11648/j.avs.20221005.14.

4. Guo J., Hou L., Zhou J., Wang D., Cui Y., Feng X., Liu J. Porcine Circovirus Type 2 Vaccines: Commercial Application and Research Advances. Viruses. 2022; 14(9):2005. DOI: 10.3390/v14092005.

5. Coronado L., Perera C.L., Rios L., Frías M.T., Pérez L.J. A Critical Review about Different Vaccines against Classical Swine Fever Virus and Their Repercussions in Endemic Regions. Vaccines (Basel). 2021; 9(2):154. DOI: 10.3390/vaccines9020154.

6. Kamel M., El-Sayed A., Castañeda Vazquez H. Foot-and-mouth disease vaccines: recent updates and future perspectives. Arch Virol. 2019; 164(6):1501-1513. DOI: 10.1007/s00705-019-04216-x.

7. Suarez D.L., Pantin-Jackwood M.J. Recombinant viral-vectored vaccines for the control of avian influenza in poultry. Vet Microbiol. 2017; 206:144-151. DOI: 10.1016/j.vetmic.2016.11.025.

8. Maki J., Guiot A.L., Aubert M., Brochier B., Cliquet F., Hanlon C.A., King R., Oertli E.H., Rupprecht C.E., Schumacher C., Slate D., Yakobson B., Wohlers A., Lankau E.W. Oral vaccination of wildlife using a vaccinia-rabies-glycoprotein recombinant virus vaccine (RABORAL V-RG®): a global review. Vet Res. 2017; 48(1):57. DOI: 10.1186/s13567-017-0459-9.

9. Capua I., Cattoli G., Marangon S. DIVA – a vaccination strategy enabling the detection of field exposure to avian influenza. Dev Biol (Basel). 2004; 119:229-33.

10. de Pinho Favaro M.T., Atienza-Garriga J., Martínez-Torró C., Parladé E., Vázquez E., Corchero J.L., Ferrer-Miralles N., Villaverde A. Recombinant vaccines in 2022: a perspective from the cell factory. Microb Cell Fact. 2022; 21(1):203. DOI: 10.1186/s12934-022-01929-8.

11. Ghattas M., Dwivedi G., Lavertu M., Alameh M.G. Vaccine Technologies and Platforms for Infectious Diseases: Current Progress, Challenges, and Opportunities. Vaccines (Basel). 2021; 9(12):1490. DOI: 10.3390/vaccines9121490.

12. Timm A., Enzinger C., Felder E., Chaplin P. Genetic stability of recombinant MVA-BN. Vaccine. 2006; 24(21):4618-4621. DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.08.037.

13. Zhang Z.X., Nong F.T., Wang Y.Z., Yan C.X., Gu Y., Song P., Sun X.M. Strategies for efficient production of recombinant proteins in Escherichia coli: alleviating the host burden and enhancing protein activity. Microb Cell Fact. 2022; 21 (1):191. DOI: 10.1186/s12934-022-01917-y.

14. Общая фармакопейная статья 1.7.1.0007.15 Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК. Государственная фармакопея Российской Федерации. ХIII изд. Т. 2, М.; 2015. [General Monograph 1.7.1.0007.15 Drugs Produced by Recombinant DNA Methods. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation. 13th ed. V. 2. Мoscow; 2015 (In Russ.)]

15. Решение Совета ЕЭК от 21.01.2022 № 1 «О Правилах регулирования обращения ветеринарных лекарственных средств на таможенной территории Евразийского экономического союза» [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.alta.ru/tamdoc/22sr0001/ (дата обращения: 01.01.2026).

16. International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products (VICH) : [Электронный ресурс]. – European Medicines Agency (EMA). – URL: https://www.ema.europa.eu/en/partners-networks/international-activities/multilateral-coalitions-initiatives/international-cooperation-harmonisationtechnical-requirements-registration-veterinary-medicinal-products-vich (дата обращения: 01.01.2026).

17. WOAH Terrestrial Animal Health Code (2025) [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://www.woah.org/en/woah-standards/ (дата обращения: 01.01.2026).

18. Soleimani S., Ghorani M. Cell bank system, establishment, and application in the virus research, diagnosis, and biopharmaceutical industries. Biotechnol Notes. 2025; 6:209-221. DOI: 10.1016/j.biotno.2025.08.001.

19. Nordberg R.C., Donahue R.P., Espinosa M.G., Salinas E.Y., Hu J.C., Athanasiou K.A. A cell bank paradigm for preclinical evaluation of an analogous cellular product for an allogeneic cell therapy. Biofabrication. 2024; 16 (3):10.1088/1758-5090/ad4de2. DOI: 10.1088/1758-5090/ad4de2.

20. Adamson S.R., Charlebois T.S. Genetic and phenotypic markers and their relationship to product quality and consistency. Dev Biol Stand. 1994; 83:31-44. PMID: 7883098.

21. Li Z., Rinas U. Recombinant protein production associated growth inhibition results mainly from transcription and not from translation. Microb Cell Fact. 2020; 19(1):83. DOI: 10.1186/s12934-020-01343-y.

22. Lee M., Han S.H., Kim D., Yun S., Yeom J., Kyeong M., Park S.Y., Lee D.Y. Systematic identification of genomic hotspots for high-yield protein production in CHO cells. N Biotechnol. 2025; 88:61-72. DOI: 10.1016/j.nbt.2025.04.006.

23. Davidopoulou C., Kouvelas D., Ouranidis A. COMPARING vaccine manufacturing technologies recombinant DNA vs in vitro transcribed (IVT) mRNA. Sci Rep. 2024; 14(1):21742. DOI: 10.1038/s41598-024-67797-x.

24. Luciani F., Bull R.A., Lloyd A.R. Next generation deep sequencing and vaccine design: today and tomorrow. Trends Biotechnol. 2012; 30(9):443-52. DOI: 10.1016/j.tibtech.2012.05.005.

25. Miller JM. Whole-genome mapping: a new paradigm in strain-typing technology. J Clin Microbiol. 2013; 51(4):1066-1070. DOI: 10.1128/JCM.00093-13.

26. Anindyajati A., Artarini A.A., Riani C., Retnoningrum D.S. Plasmid Copy Number Determination by Quantitative Polymerase Chain Reaction. Sci Pharm. 2016; 84(1):89-101. DOI: 10.3797/scipharm.ISP.2015.02.

27. Ng S., Gisonni-Lex L., Azizi A. New approaches for characterization of the genetic stability of vaccine cell lines. Hum Vaccin Immunother. 2017; 13(7):1669-1672. DOI: 10.1080/21645515.2017.1295191.

28. Pilely K., Johansen M.R., Lund R.R., Kofoed T., Jørgensen T.K., Skriver L., Mørtz E. Monitoring process-related impurities in biologics-host cell protein analysis. Anal Bioanal Chem. 2022; 414(2):747-758. DOI: 10.1007/s00216-021-03648-2.

29. Covarrubias C.E., Rivera T.A., Soto C.A., Deeks T., Kalergis A.M. Current GMP standards for the production of vaccines and antibodies: An overview. Front Public Health. 2022; 10:1021905. DOI: 10.3389/fpubh.2022.1021905.

30. Chooi W.H., Ng P.W., Hussain Z., Ming L.C., Ibrahim B., Koh D. Vaccine contamination: Causes and control. Vaccine. 2022; 40(12):1699-1701. DOI: 10.1016/j.vaccine.2022.02.034.

31. Pastoret P.P. Human and animal vaccine contaminations. Biologicals. 2010; 38(3):332-334. DOI: 10.1016/j.biologicals.2010.02.015.

32. Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Сальманова Г.Р., Шангараев Р.И., Тарасова Е.Ю. Дизайн специфических олигонуклеотидов для выявления контаминации культур клеток возбудителем вирусной диареи и микоплазмами при разработке интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят. Ветеринарный врач. 2025; 3: 98-104. DOI: 10.33632/1998-698Х_2025_3_98/

33. Raza S., Wdowiak M., Paczesny J. An Overview of Diverse Strategies To Inactivate Enterobacteriaceae-Targeting Bacteriophages. EcoSal Plus. 2023; 11(1):eesp00192022. DOI: 10.1128/ecosalplus.esp-0019-2022.

34. Kilic P., Karabudak S., Cosar B., Savran B.N., Yalcin M. Residual protein analysis by SDS-PAGE in clinically manufactured BM-MSC products. Electrophoresis. 2024; 45(17-18):1606-1617. DOI: 10.1002/elps.202300286.

35. Alonso Villela S.M., Kraïem H., Bouhaouala-Zahar B., Bideaux C., Aceves Lara C.A., Fillaudeau L. A protocol for recombinant protein quantification by densitometry. Microbiology Open. 2020; 9(6):1175-1182. DOI: 10.1002/mbo3.1027.

36. Maestri A., Ehrenborg E., Werngren O., Olin M., Hagberg C.E., Pedrelli M., Parini P. Titration-WB: A methodology for accurate quantitative protein determination overcoming reproducibility errors. PLoS One. 2025; 20(6):e0325052. DOI: 10.1371/journal.pone.0325052.

37. Luo X., Ma Y., Xiang Q. New Frontiers in the Production of Functional Recombinant Proteins. Bioengineering (Basel). 2025; 12(4):351. DOI: 10.3390/bioengineering12040351.

38. Солдатенкова А.В., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А. Разработка иммуноферментного метода контроля качества вакцины на основе гибридного рекомбинантного белка P. aeruginosa. Медицинская иммунология. 2020; 22(4):805-810. DOI: 10.15789/1563-0625-DOE-1906.

39. Dobrowolski M., Urbaniak M., Pietrucha T. Peptide Mapping for Sequence Confirmation of Therapeutic Proteins and Recombinant Vaccine Antigens by High-Resolution Mass Spectrometry: Software Limitations, Pitfalls, and Lessons Learned. Int J Mol Sci. 2025; 26(20):9962. DOI: 10.3390/ijms26209962.

40. Smith J.S., Sandoval W., Xiang B., Mawuenyega K., Suckau D., Katta V., Walters J.J., Hunziker P., Remmer H. Protein Sequencing Research Group(PSRG): Results of the PSRG 2011 Study: Sensitivity Assessment of Edman and Mass Spectrometric Terminal Sequencing of an Unknown Protein. J Biomol Tech. 2011; 22(Suppl):S71. PMCID: PMC3186630.

41. Wright J.F. Product-Related Impurities in Clinical-Grade Recombinant AAV Vectors: Characterization and Risk Assessment. Biomedicines. 2014; 2(1):80-97. DOI: 10.3390/biomedicines2010080. PMID: 28548061; PMCID: PMC5423478.

42. Wang W., Ignatius A.A., Thakkar S.V. Impact of residual impurities and contaminants on protein stability. J Pharm Sci. 2014; 103(5):1315-30. DOI: 10.1002/jps.23931.

43. Wilson L.J., Lewis W., Kucia-Tran R., Bracewell D.G. Identification and classification of host cell proteins during biopharmaceutical process development. Biotechnol Prog. 2022; 38(1):e3224. DOI: 10.1002/btpr.3224.

44. WHO. WHO Expert Committee on Biological standardization: Highlights of the 46th meeting, October 1996. WHO Wkly Epidemiol. Rec. 72, 1997, 141–145.

45. Ёлшин Н.Д. Определение остаточной ДНК клеток-продуцентов E. coli и CHO в субстанциях рекомбинантых белков методом qPCR. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(4): 245-252.

46. Wingfield P.T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 2015; 80:6.1.1-6.1.35. DOI: 10.1002/0471140864.ps0601s80.

47. Reinmuth-Selzle K., Tchipilov T., Backes A.T., Tscheuschner G., Tang K., Ziegler K., Lucas K., Pöschl U., FröhlichNowoisky J., Weller M.G. Determination of the protein content of complex samples by aromatic amino acid analysis, liquid chromatography-UV absorbance, and colorimetry. Anal Bioanal Chem. 2022; 414(15):4457-4470. DOI: 10.1007/s00216-022-03910-1.

48. Rosenberg A.S., Sauna Z.E. Immunogenicity assessment during the development of protein therapeutics. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2018; 70(5): 584-594. DOI: 10.1111/jphp.12810.

49. Lilley E., Coppens E., Das P., Galaway F., Isbrucker R., Sheridan S., Stickings P., Holmes A. Integrating 3Rs approaches in WHO guidelines for the batch release testing of biologicals: Responses from a survey of vaccines and biological therapeutics manufacturers. Biologicals. 2023; 81:101660. DOI: 10.1016/j.biologicals.2022.11.002.

50. Eon-Duval A., Broly H., Gleixner R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: an assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnol Prog. 2012; 28(3):608-622. DOI: 10.1002/btpr.1548.

51. Rantanen J., Khinast J. The Future of Pharmaceutical Manufacturing Sciences. J Pharm Sci. 2015; 104(11):3612-3638. DOI: 10.1002/jps.24594.

52. Sun M., Wang S., Fang Z., Zhao M., Gao Y., An T., Tu Y., Wang H., Cai X. A Sandwich ELISA for Quality Control of PCV2 Virus-like Particles Vaccine. Vaccines (Basel). 2022; 10(12):2175. DOI: 10.3390/vaccines10122175.

53. Huang X.D., Tong W.W., Fan X.L., Li Z.H. Application of HPLC-ESI-ITMS in the quality control of carboxyterminal sequence confirmation for the recombinant DNA product Hirudin Variant 3. J Pharm Biomed Anal. 2007; 43(2):533-539. DOI: 10.1016/j.jpba.2006.08.009.

54. de Marco A., Berrow N., Lebendiker M., Garcia-Alai M., Knauer S.H., Lopez-Mendez B., Matagne A., Parret A., Remans K., Uebel S., Raynal B. Quality control of protein reagents for the improvement of research data reproducibility. Nat Commun. 2021; 12(1):2795. DOI: 10.1038/s41467-021-23167-z.

55. Grimm H., Biller-Andorno N., Buch T., Dahlhoff M., Davies G., Cederroth C.R., Maissen O., Lukas W., Passini E., Törnqvist E., Olsson I.A.S., Sandström J. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Front Vet Sci. 2023; 10:1185706. DOI: 10.3389/fvets.2023.1185706.