Сравнительный анализ эффективности протоколов центрифугирования для предварительной обработки спермы производителей

В современном животноводстве репродуктивные биотехнологии, такие как искусственное осеменение (ИО), играют ключевую роль в повышении продуктивности и улучшении генетического потенциала сельскохозяйственных животных. ИО позволяет не только максимально эффективно использовать генетический материал выдающихся производителей на большем количестве самок, но и снизить риск распространения инфекционных заболеваний, передающихся половым путем. Успех ИО во многом определяется качеством используемой спермы, которое зависит от методов обработки и хранения эякулята. Среди существующих методов селекции сперматозоидов, центрифугирование занимает одно из ведущих мест. Это метод основан на разделении компонентов эякулята под воздействием центробежной силы. В практике центрифугирования выделяют два основных подхода: стандартное и коллоидное центрифугирование. Стандартное центрифугирование представляет собой однократное разделение компонентов эякулята, при этом режим центрифугирования подбирается в соответствие видовым особенностями сперматозоидов: 200-400 об/мин в течение 5-12 мин для грызунов, 720 об/мин в течение 5 мин для собак, 2400 об/мин в течение 5 мин для жеребцов, 5000 об/мин в течение 5 мин для быков, 3000 об/мин в течение 3 мин для козлов, 2400 об/мин в течение 3 мин для кабанов Коллоидное центрифугирование предусматривает использование специальных коллоидных растворов (Percolltm, Isolate®, Porcicoll®, Bovicoll®, Equipure Bottom Layer®, PureSperm®) для более эффективного отделения сперматозоидов с наилучшими морфологическими и функциональными характеристиками. Коллоидное центрифугирование позволяет получить эякулят более высокого качества, поскольку с его помощью можно отделить не только семенную плазму, но и дефектные, малоподвижные сперматозоиды, а также клетки с поврежденной ДНК.

1. Бычкова О.В., Хлебова Л.П. Сельскохозяйственная биотехнология : учебное пособие. СПб. : Троицкий мост; 2023: 244 с.

2. Al-Kass Z., Morrell J.M., Ntallaris T. Effect of Centrifugation of Stallion Semen Through a Low Density Colloid Prior to Freezing on Sperm Cryosurvival. Animals. 2025;15:1881.

3. Al-Kass Z., Brown A., Johannisson A., Ntallaris T., Morrell J.M. Variation among stallions in sperm quality after single layer centrifugation. Reprod. Domest. Anim. 2021;56:848–856.

4. Arias M.E., Andara K., Briones E., Felmer R. Bovine sperm separation by Swim-up and density gradients (Percoll and BoviPure): Effect on sperm quality, function and gene expression. Reprod Biol. 2017 Jun;17 (2):126-132. Epub 2017 Mar 28. PMID: 28363502. doi: 10.1016/j.repbio.2017.03.002

5. Brinsko S.P., Crockett E.C., Squires E.L.. Effect of centrifugation and partial removal of seminal plasma on equine spermatozoal motility after cooling and storage. Theriogenology. 2000;54(1):129-136,

6. Boulton V.N., Braude P.R. Preparation of human spermatozoa for in vitro fertilisation by isopycnic centrifugation of self-generating density gradients. Arch Androl. 1984; 13: 176-176.

7. Carvajal G., Cuello C., Ruiz M., Vázquez J.M., Martínez E.A., Roca J. Efects of centrifugation before freezing on boar sperm cryosurvival. J. Androl. 2004;25:389–96. https://doi.org/10.1002/j.19394640.2004.tb02805.x

8. Cojkic A., Hansson I., Johannisson A., Axner E., Morrell J.M. Single layer centrifugation as a method for bacterial reduction in bull semen for assisted reproduction. Vet Res Commun. 2024 Feb;48(1):39-48. doi: 10.1007/s11259-023-10178-y. Epub 2023 Jul 22. PMID: 37479850; PMCID: PMC10811171.

9. Dorado J., Alcaráz L., Duarte N., Portero J.M., Acha D., Demyda S., Muñoz-Serrano A., Hidalgoet M. Centrifugation on PureSperm(®) density-gradient improved quality of spermatozoa from frozen-thawed dog semen. Theriogenology. 2011. Jul 15;76(2):381-5. doi: 10.1016/j.theriogenology.2011.02.026. Epub 2011 Apr 15. PMID: 21497393.

10. Dozortsev D., Rybouchkin A., De Sutter P., Dhont M. Sperm Plasma membrane damage prior to intracytoplasmic sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. Hum. Reprod. 1995; 10: 2960-2964.

11. Webb G.W., Dean M.M. Effect of Centrifugation Technique on Post-storage Characteristics of Stallion Spermatozoa. Journal of Equine Veterinary Science. 2009;29(9):675-680.

12. Gloria A., Cunto M., Zambelli D., Bracco C., Ballotta G., Contri A. Cushioned and high-speed centrifugation improve sperm recovery rate but affect the quality of fresh and cryopreserved feline spermatozoa. Theriogenology, 2024;215:195-204.

13. Goodla L., Morrell J.M., Yusnizar Y. Quality of bull spermatozoa after preparation by single-layer centrifugation. J Dairy Sci. 2014;97(4):2204–2212. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7607

14. Gutiérrez-Cepeda L., Crespo F., Blazquez J.C., Serres C. Optimization of the Equine-Sperm Freeze Test in Purebred Spanish Horses by Incorporating Colloidal Centrifugation. Animals (Basel). 2023 Jan 22;13(3):382. doi: 10.3390/ani13030382. PMID: 36766271; PMCID: PMC9913238.

15. Gutiérrez-Cepeda L., Fernández S., Crespo F., Gósalvez J., Serreset C. Simple and economic colloidal centrifugation protocols may be incorporated to the clinical equine sperm processing procedure. Anim. Reprod. Sci. 2011, 124, 85–89

16. Henkel R.R., Schill W.B. Sperm preparation for ART. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003; 1: 108. https://dx.doi.org./10.1186/1477-7827-1-108

17. Hlinka D., Herman M., Vesela J., Hredzak R., Horvath S., Pacin J. A modified method of intracytoplasmic sperm injection without the use of polyvinylpyrrolidone. Hum. Reprod. 1998; 13: 1922-1927.

18. Hoogewijs M., Rijsselaere T., De Vliegher S., Vanhaesebrouck E., De Schauwer C., Govaere J. Infuence of diferent centrifugation protocols on equine semen preservation. Theriogenology. 2010;74:118–26. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.01.022

19. Hopkins H.S. Centrifugation Cushion vs. Spermfilter™: Effects On % Recovery". Graduate Theses. 2023. Dissertations. 3924.

20. Katkov I.I., Mazur P. Infuence of centrifugation regimes on motility, yield, and cell associations of mouse spermatozoa. J. Androl. 1998;19:232–41. https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.1998.tb01993.x.

21. Knop K., Hofmann N., Rath D., Sieme H. Efects of cushioned centrifuga‑ tion technique on sperm recovery and sperm quality in stallions with good and poor semen freezability. Anim Reprod Sci. 2005;89:294–7.

22. Lacalle E., Fernández-Alegre E., Soriano-Úbeda C., Martínez-Martínez S., Domínguez J.C., GonzálezMontaña J.R., Morrell J.M., Martínez-Pastor F. Single layer centrifugation (SLC) for bacterial removal with Porcicoll positively modifies chromatin structure in boar spermatozoa. Theriogenology. 2023 Apr 15;201:95-105. doi: 10.1016/j.theriogenology.2023.02.017. Epub 2023 Feb 20. PMID: 36857978.

23. Machado G.M., Carvalho J.O., Filho E.S., Caixeta E.S., Franco M.M., Rumpf R. Efect of Percoll volume, duration and force of centrifugation, on in vitro production and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology. 2009;71:1289–97. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.01. 002

24. Mack S.R., Zaneveld L.J.D. Acrosomal enzymes and ultrastructure of unfrozen and cryotreated human spermatozoa. Gamete Res. 1987;18:375–83. https://doi.org/10.1002/mrd.1120180411

25. Morrell J.M. Effect of colloid centrifugation on boar sperm quality during storage and function in in vitro fertilization. Theriogenology. 2019 Oct 1;137:122-126. doi: 10.1016/j.theriogenology.2019.05.046. Epub 2019 May 31. PMID: 31176492.

26. Naing W.S., Haron W.A., Goriman M.A.K., Yusof R., Bakar M.Z.A., Sarsaif K. Efect of seminal plasma removal, washing solutions, and centrifugation regimes on boer goat semen cryopreservation. Pertanika J Trop Agric Sci. 2011;34:271–9.

27. Neila-Montero M., Riesco M.F., Alvarez M., Montes-Garrido R., Boixo J.C., de Paz P., Anel-Lopez L., Anel L. Centrifugal force assessment in ram sperm: identifying species-specific impact. Acta Vet Scand. 2021 Nov 4;63(1):42. doi: 10.1186/s13028-021-00609-8. PMID: 34736507; PMCID: PMC8567708.

28. Nicolas M., Alvarez M., Gomes-Alves S., Mata-Campuzano M., Borragán S., Martinez-Pastor F. Efects on brown bear (Ursus arctos) spermatozoa freezability of diferent extender and dilution ratios used for prefreezing centrifugation. Eur J Wildl Res. 2011;57:259–66. https://doi.org/10.1007/s10344-010-0420-y

29. Quinn M.M., Jalalian L., Ribeiro S., Ona K., Demirci U., Cedars M.I., Rosen M.P. Microfluidic sorting selects sperm for clinical use with reduced DNA damage compared to density gradient centrifugation with swim-up in split semen samples. Hum. Reprod. 2018; 33(8): 1388-93. https://dx.doi.org./10.1093/humrep/dey239

30. Rijsselaere T., Van Soom A., Maes D., de Kruif A. Efect of centrifugation on in vitro survival of fresh diluted canine spermatozoa. Theriogenology. 2002;57:1669–81. https://doi.org/10.1016/S0093-691X(02)00663-5

31. Sepúlveda B., Arias M.E., Aguila L., Zambrano F., Sánchez R., Felmer R. Gradient sperm selection for reproductive techniques in cattle: Is Isolate a suitable replacement for Percoll? Andrologia. 2018 Apr;50(3). doi: 10.1111/and.12921. Epub 2017 Nov 21. PMID: 29164653.

32. Sepúlveda B., Arias M.E., Aguila L., Zambrano F., Sánchez R., Felmer R. Gradient sperm selection for reproductive techniques in cattle: Is Isolate a suitable replacement for Percoll? Andrologia. 2018 Apr;50(3). doi: 10.1111/and.12921. Epub 2017 Nov 21. PMID: 29164653.

33. Rijsselaere T., Van Soom A., Maes D., de Kruif A. Efect of centrifugation on in vitro survival of fresh diluted canine spermatozoa. Theriogenology. 2002;57:1669–81. https://doi.org/10.1016/S0093-691X(02)00663-5

34. Varner D.D., Love C.C., Blanchard T.L. Breeding-management strategies and semen-handling techniques for stallions. Proc Annu Conv Am Assoc Eq Pract . 2010:56: 215–26.